一、暗視野觀察

暗視野實(shí)際是暗場(chǎng)照明發(fā).它的特點(diǎn)和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場(chǎng)成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象.

暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象,微塵在強(qiáng)光直射通過(guò)的情況下,人眼不能觀察,這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見.

暗視野觀察所需要的附件是暗視野聚光鏡.它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過(guò)被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進(jìn)入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察,高達(dá)0.02—0.004

二、相差鏡檢法

在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過(guò)程中,相差鏡檢術(shù)的發(fā)明成功,是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就.我們知道,人眼只能區(qū)分光波的波長(zhǎng)(顏色)和振幅(亮度),對(duì)于無(wú)色通明的生物標(biāo)本,當(dāng)光線通過(guò)時(shí),波長(zhǎng)和振幅變化不大,在明場(chǎng)觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象,將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?即使是無(wú)色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見.這大大便利了活體細(xì)胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡.

相差顯微鏡的基本原理是,把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見.光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來(lái)的光路,同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng)),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差.在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處:

1.環(huán)形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上.

2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.分為兩種:

(1).A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱負(fù)反差).

(2).B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗